近日，中國海洋大學食品科學與工程學院、海洋食品加工與安全控制國家重點實驗室薛長湖院士團隊課題組的研究成果“Silkworm cocoon-like nanocoatings for single-cell encapsulation of probiotics:Construction,mechanism and characterization”在《Food Bioscience 》期刊上發(fā)表。
本研究以植物乳桿菌（L. plantarum）為模型，首次結(jié)合全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)（Microbial Microdroplet Culture system ， MMC），在pH 3.0-6.0條件下篩選多糖/蛋白材料：羧甲基殼聚糖 （CMCS）、殼寡糖 （COS）、支鏈淀粉 （AP） 和果膠 （PE） 四種多糖，以及明膠 （GE）、乳清分離蛋白 （WPI）、卵清蛋白 （OVA） 和大豆分離蛋白 （SPI） 四種蛋白質(zhì)等，構(gòu)建厚度為100-150 nm的蠶繭狀涂層。通過MMC實時監(jiān)測涂層對益生菌生長的影響，隨后，通過傅里葉變換紅外光譜（FTIR）等分析表明，靜電相互作用、氫鍵和疏水相互作用是涂層與植物乳桿菌之間的主要驅(qū)動力。此外，COS 涂層促進了植物乳桿菌的生長和繁殖，而 CMCS 和 OVA 則抑制了植物乳桿菌的生長和繁殖。最后，COS 、 WPI 和 GE 涂層作為屏障都提高了植物乳桿菌在巴氏殺菌、凍融循環(huán)和貯藏條件下的存活率。其中，COS 作為一種海洋低聚糖，由于其優(yōu)異的性能和形成的致密涂層，對植物乳桿菌的保護效果最好。
一、研究背景
1.益生菌
益生菌通過定植腸道調(diào)節(jié)菌群，改善免疫、代謝疾病及胃腸道功能，但其在加工、儲存中易受溫度、pH等環(huán)境脅迫失活。
2.封裝技術(shù)
傳統(tǒng)多細胞封裝存在顆粒大、效率低等問題，而單細胞封裝可直接遞送活性益生菌至靶點，同時減少對食品感官的影響。
3.封裝材料
可食用蛋白（如WPI、GE）和多糖（如CMCS、COS）因生物相容性、安全性及功能多樣性成為理想包材，但其在益生菌封裝中的應用機制尚不明確。
二、方法與技術(shù)平臺
1.材料篩選
本研究同時測試了8種涂層材料，包括四種多糖 (CMCS、COS、AP和PE) 以及四種蛋白質(zhì) (GE、WPI、OVA和SPI) 作為包衣材料。篩選結(jié)果顯示，PE和SPI都不能在植物乳桿菌表面形成涂層，選擇CMCS、COS、AP、GE、WPI和OVA等6種材料作為后續(xù)實驗的涂層材料。
考慮到酸性環(huán)境不利于植物乳桿菌的生長，而在pH 5.0和pH 6.0下，大多數(shù)涂層材料攜帶相對較少的正電荷并且不能通過靜電相互作用與植物乳桿菌很好地結(jié)合。因此，pH 4.0被選為最合適的制劑研究其余部分的環(huán)境。
2.高通量評估涂層生物相容性
為了更好地驗證在pH 4.0條件下不同材料的包封效果，本研究采用了全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)（MMC），MMC具備連續(xù)監(jiān)測能力，可精準捕捉涂層對菌體不同生長階段的調(diào)控（如延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期）。通過MMC自動生成實時生長曲線（每30分鐘記錄OD600值，持續(xù)14小時），根據(jù)生長曲線的結(jié)果選擇合適的涂層材料進行后續(xù)實驗。
結(jié)果如圖所示，PL@GE、PL@WPI和PL@AP的生長與游離L. plantaurum的生長沒有顯著差異；GE、WPI和AP涂層的存在不會影響植物乳桿菌的正常生長和增殖。而PL@COS的生長明顯優(yōu)于游離的植物乳桿菌，推測歸因于COS在改善腸道有益菌增殖方面的作用。相反，PL@CMCS 和PL@OVA的生長比游離L. plantaurum差。因此在接下來的研究中，選擇WPI、GE、COS和AP作為下一階段實驗的涂層材料。
3.涂層-菌體動態(tài)互作機制解析
本研究設計了一種類似蠶繭結(jié)構(gòu)的納米涂層，旨在通過這種結(jié)構(gòu)為益生菌提供保護。該涂層能夠有效保護益生菌免受胃酸、膽汁鹽以及消化酶等胃腸道內(nèi)環(huán)境的不利影響。
通過電熒光顯微鏡和TEM進一步證實了納米涂層的存在和蠶繭狀結(jié)構(gòu)。此外，傅里葉變換紅外光譜（FTIR） 分析顯示，靜電吸引、氫鍵和疏水相互作用參與PL@CMCS、PL@COS、PL@GE、PL@WPI和 PL@OVA的形成，而PL@AP的形成僅包括氫鍵和疏水鍵相互作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)COS涂層可以促進植物乳桿菌的生長，而CMCS和OVA涂層對植物乳桿菌具有抑制作用。
結(jié)果表明，涂層對植物乳桿菌凍融穩(wěn)定性的提高程度依次為COS、AP、GE、WPI。多糖涂層對植物乳桿菌凍融穩(wěn)定性的影響優(yōu)于蛋白質(zhì)涂層，因為多糖具有很強的持水能力，可以阻礙水分遷移。這四種涂層作為物理屏障可以有效地隔離不利的環(huán)境條件。
其中，COS涂層對提高植物乳桿菌在4℃下的貯藏穩(wěn)定性效果最好。以COS為代表的功能性低聚糖不僅可以作為抵抗不利外界環(huán)境的物理屏障，還可以作為益生元進一步擴大功能性低聚糖的應用范圍。COS作為一種涂料具有阻隔和益生元的雙重性能，比其他涂料具有更好的保護作用。
這是第一篇研究不同包膜材料和pH值對蠶繭狀納米包膜植物乳桿菌制備的影響，并闡明了包膜形成機制的論文。所得結(jié)果將為新型包衣益生菌的開發(fā)及其在功能食品工業(yè)中的應用提供理論依據(jù)。、
關(guān)于MMC
關(guān)于天木生物
天木生物專注于生物育種領(lǐng)域的高端儀器裝備的開發(fā)與應用，致力于通過高效的突變技術(shù)和高通量篩選技術(shù)，改造提升產(chǎn)業(yè)傳統(tǒng)菌種開發(fā)模式，為生物制造產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效，提升我國生物產(chǎn)業(yè)的核心競爭力。
致力于為行業(yè)“細胞和菌種開發(fā)與篩選效率低”、“相關(guān)裝備成本昂貴”、“產(chǎn)業(yè)化落地困難”等難題提供優(yōu)秀的解決方案。
近日，中國海洋大學食品科學與工程學院、海洋食品加工與安全控制國家重點實驗室薛長湖院士團隊課題組的研究成果“Silkworm cocoon-like nanocoatings for single-cell encapsulation of probiotics:Construction,mechanism and characterization”在《Food Bioscience 》期刊上發(fā)表。
本研究以植物乳桿菌（L. plantarum）為模型，首次結(jié)合全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)（Microbial Microdroplet Culture system ， MMC），在pH 3.0-6.0條件下篩選多糖/蛋白材料：羧甲基殼聚糖 （CMCS）、殼寡糖 （COS）、支鏈淀粉 （AP） 和果膠 （PE） 四種多糖，以及明膠 （GE）、乳清分離蛋白 （WPI）、卵清蛋白 （OVA） 和大豆分離蛋白 （SPI） 四種蛋白質(zhì)等，構(gòu)建厚度為100-150 nm的蠶繭狀涂層。通過MMC實時監(jiān)測涂層對益生菌生長的影響，隨后，通過傅里葉變換紅外光譜（FTIR）等分析表明，靜電相互作用、氫鍵和疏水相互作用是涂層與植物乳桿菌之間的主要驅(qū)動力。此外，COS 涂層促進了植物乳桿菌的生長和繁殖，而 CMCS 和 OVA 則抑制了植物乳桿菌的生長和繁殖。最后，COS 、 WPI 和 GE 涂層作為屏障都提高了植物乳桿菌在巴氏殺菌、凍融循環(huán)和貯藏條件下的存活率。其中，COS 作為一種海洋低聚糖，由于其優(yōu)異的性能和形成的致密涂層，對植物乳桿菌的保護效果最好。
一、研究背景
1.益生菌
益生菌通過定植腸道調(diào)節(jié)菌群，改善免疫、代謝疾病及胃腸道功能，但其在加工、儲存中易受溫度、pH等環(huán)境脅迫失活。
2.封裝技術(shù)
傳統(tǒng)多細胞封裝存在顆粒大、效率低等問題，而單細胞封裝可直接遞送活性益生菌至靶點，同時減少對食品感官的影響。
3.封裝材料
可食用蛋白（如WPI、GE）和多糖（如CMCS、COS）因生物相容性、安全性及功能多樣性成為理想包材，但其在益生菌封裝中的應用機制尚不明確。
二、方法與技術(shù)平臺
1.材料篩選
本研究同時測試了8種涂層材料，包括四種多糖 (CMCS、COS、AP和PE) 以及四種蛋白質(zhì) (GE、WPI、OVA和SPI) 作為包衣材料。篩選結(jié)果顯示，PE和SPI都不能在植物乳桿菌表面形成涂層，選擇CMCS、COS、AP、GE、WPI和OVA等6種材料作為后續(xù)實驗的涂層材料。
考慮到酸性環(huán)境不利于植物乳桿菌的生長，而在pH 5.0和pH 6.0下，大多數(shù)涂層材料攜帶相對較少的正電荷并且不能通過靜電相互作用與植物乳桿菌很好地結(jié)合。因此，pH 4.0被選為最合適的制劑研究其余部分的環(huán)境。
2.高通量評估涂層生物相容性
為了更好地驗證在pH 4.0條件下不同材料的包封效果，本研究采用了全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)（MMC），MMC具備連續(xù)監(jiān)測能力，可精準捕捉涂層對菌體不同生長階段的調(diào)控（如延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期）。通過MMC自動生成實時生長曲線（每30分鐘記錄OD600值，持續(xù)14小時），根據(jù)生長曲線的結(jié)果選擇合適的涂層材料進行后續(xù)實驗。
結(jié)果如圖所示，PL@GE、PL@WPI和PL@AP的生長與游離L. plantaurum的生長沒有顯著差異；GE、WPI和AP涂層的存在不會影響植物乳桿菌的正常生長和增殖。而PL@COS的生長明顯優(yōu)于游離的植物乳桿菌，推測歸因于COS在改善腸道有益菌增殖方面的作用。相反，PL@CMCS 和PL@OVA的生長比游離L. plantaurum差。因此在接下來的研究中，選擇WPI、GE、COS和AP作為下一階段實驗的涂層材料。
3.涂層-菌體動態(tài)互作機制解析
本研究設計了一種類似蠶繭結(jié)構(gòu)的納米涂層，旨在通過這種結(jié)構(gòu)為益生菌提供保護。該涂層能夠有效保護益生菌免受胃酸、膽汁鹽以及消化酶等胃腸道內(nèi)環(huán)境的不利影響。
通過電熒光顯微鏡和TEM進一步證實了納米涂層的存在和蠶繭狀結(jié)構(gòu)。此外，傅里葉變換紅外光譜（FTIR） 分析顯示，靜電吸引、氫鍵和疏水相互作用參與PL@CMCS、PL@COS、PL@GE、PL@WPI和 PL@OVA的形成，而PL@AP的形成僅包括氫鍵和疏水鍵相互作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)COS涂層可以促進植物乳桿菌的生長，而CMCS和OVA涂層對植物乳桿菌具有抑制作用。
結(jié)果表明，涂層對植物乳桿菌凍融穩(wěn)定性的提高程度依次為COS、AP、GE、WPI。多糖涂層對植物乳桿菌凍融穩(wěn)定性的影響優(yōu)于蛋白質(zhì)涂層，因為多糖具有很強的持水能力，可以阻礙水分遷移。這四種涂層作為物理屏障可以有效地隔離不利的環(huán)境條件。
其中，COS涂層對提高植物乳桿菌在4℃下的貯藏穩(wěn)定性效果最好。以COS為代表的功能性低聚糖不僅可以作為抵抗不利外界環(huán)境的物理屏障，還可以作為益生元進一步擴大功能性低聚糖的應用范圍。COS作為一種涂料具有阻隔和益生元的雙重性能，比其他涂料具有更好的保護作用。
這是第一篇研究不同包膜材料和pH值對蠶繭狀納米包膜植物乳桿菌制備的影響，并闡明了包膜形成機制的論文。所得結(jié)果將為新型包衣益生菌的開發(fā)及其在功能食品工業(yè)中的應用提供理論依據(jù)。、
關(guān)于MMC
關(guān)于天木生物
天木生物專注于生物育種領(lǐng)域的高端儀器裝備的開發(fā)與應用，致力于通過高效的突變技術(shù)和高通量篩選技術(shù)，改造提升產(chǎn)業(yè)傳統(tǒng)菌種開發(fā)模式，為生物制造產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效，提升我國生物產(chǎn)業(yè)的核心競爭力。
致力于為行業(yè)“細胞和菌種開發(fā)與篩選效率低”、“相關(guān)裝備成本昂貴”、“產(chǎn)業(yè)化落地困難”等難題提供優(yōu)秀的解決方案。
